質粒的構建：啟動子的選擇
啟動子的選擇對于轉染基因的有效表達是非常重要的。對于轉染過程本身雖然無甚影響，但是對轉染結果卻有著微妙的影響。
啟動子可分為2大類：誘導型啟動子是比較精明的，平時歇著，一旦接到誘導信號指示就馬上開工干活兒。而組成型啟動子比較老實的，就是從頭到尾不停干活從不閑著的那種——比如我們很熟悉的CMV啟動子啊，SV40啊，pMC1啊，PGK啟動子啊等等。
獲得高轉染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數細胞類型中可以獲得高表達活性。在BHK-21中，CMV啟動子活性比其他啟動子如SV40和RSV都要高。但這三種病毒啟動子在T細胞來源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低。轉染后在培養基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細胞中CMV啟動子，而單PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白細胞）中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。
一個強悍的高表達組成型啟動子是我們做表達所求之不得的，但是對于轉染本身來說卻不一定好——因為任何持續過高表達外源基因都可能帶來某種程度的細胞毒性，影響細胞生長——如果外源基因本身對細胞生長有毒，那更完蛋了，你很可能篩不到轉染成功的細胞株，更別提穩定轉染了——因為過量表達本身可能已經害死了那個轉染了的細胞，沒轉染的細胞又死于篩選壓力。這種時候一個不那么“能干”的啟動子可能更適合一些。如果你曾經遇到原因不明的轉染失敗案例，會不會是這個原因呢？過猶不及就是這個道理咯。
誘導型啟動子對于轉染來說，特別是穩定轉染，可能是更好的選擇。它使得目的基因的表達可以受到我們的調控——轉染的時候不表達，篩選穩定表達株后再誘導表達，使得表達有毒性的基因或者分析表達產物的生物學效應成為可能。多數誘導型啟動子在接受某種信號后“打開開關”開始工作，也有的相反，在缺失某種信號后打開開關。Clontech還有個誘導系統是“劑量依賴的”，就是說不單表達開關可控，表達量多少也可以通過誘導劑的量來調控。還有一種特殊的啟動子很好玩——具有時序性或者組織特異性（空間特異性），會受到特定的元件調控，在一定的時間或者特定組織細胞中表達的，比如那個轉基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺細胞中表達的啟動子——有人說這是組成型的，我覺得應該是誘導型的，只不過誘導的因素我們不知道罷了，這類啟動子在不同的細胞中會有不同的表現，需要注意。誘導系統的問題主要是本底表達，表達量有限，以及誘導劑本身對細胞的影響和如何清除，不過這些都與轉染無關。
轉染DNA的啟動子-增強子如果不被宿主細胞識別也會產生無法表達的“悲劇”，這是實驗設計時需要注意的問題。不過現在利用現成試劑盒或者模擬國外已經成功的實驗的居多，獨立構建表達系統的極少，因而這種問題遇到的幾率也幾乎可以忽略不計。

目的基因
這個對于研究人員來說是目的，因而沒有選擇的余地。如果你的目的基因正好會影響選定細胞株的生長，甚至有毒，那hao選擇一個誘導型的啟動子，不然你可能總是轉染不了。但是通常在實驗之前我們不清楚我們研究的基因產物是否對選定的細胞有毒，所以正負對照很重要。當排除其他原因后轉染總是失敗，應當從根本上考慮原因。

質粒的大小和質量
線性化還是超螺旋會影響轉染結果：超螺旋質粒的轉染效率比線性DNA高得多，特別是瞬時轉染。而線性化DNA轉染的整合幾率高。質粒太大了轉染會困難一些。畢竟，相對致密、較小的外源異物被細胞內吞的幾率要大一些。如果你的質粒正好比較大，又沒有經驗，選擇特別注明可以轉大質粒的轉染試劑成功幾率會高一些。有的轉染試劑還會提供一些促進DNA凝聚的成分，使得DNA形成轉染復合物時更致密一些，更容易轉染一些。
純化質粒的質量無疑會影響轉染效率。哺乳動物細胞總歸是比大腸桿菌嬌氣，轉染難度高些，因而要求的DNA純度要更高些。早年要做轉染真是大陣仗啊，光是提質粒做超離就令人皺眉。令人頭疼的是內毒素了。內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上*的成分，主要是脂多糖中的類脂A（lipopolysaccharides），在細菌被裂解時被釋放出來，由于其化學結構和特性，在質粒提取的過程中內毒素很容易混入質粒DNA中共同純化出來。內毒素的存在會嚴重地影響轉染效率，此外內毒素可能會激活造血細胞（例如B細胞、巨嗜細胞等）的非特異免疫反應，造成實驗中的假陽性。所以質粒DNA轉染時應盡量采用無內毒素污染的超純質粒。幸好技術的進步令復雜的操作成為過去，多數實驗室會選擇使用轉染級別的質粒純化試劑盒純化的質粒來轉染。對于一些“耐受性高、容易操作的”細胞株，普通的Kit已經夠了。對于一些對內毒素特別敏感的細胞，就要用“去內毒素”的質粒純化Kit了。

質粒DNA的濃度和量
既然質粒純化已經不成問題，初學者通常都不會在乎甚至愿意多加點DNA，但是要注意的是，DNA量過少固然轉染效率不高，DNA量過多同樣會降低轉染效率。有的初學者習慣按照說明書123地去操作而不求甚解，你“知其然”是否還“知其所以然”呢？DNA:轉染試劑的比例的優化是非常重要的，特別是對于陽離子脂質體、多胺等帶電荷的轉染試劑來說，DNA-轉染復合物所帶的凈電荷是由轉染試劑和DNA的比例決定的，而轉染復合物是否能更好地結合到帶負電的細胞膜上，很大程度取決于這個凈電荷。所以預實驗需要按照說明書的要求，按一定比例混合適量的質粒DNA和轉染試劑。有的轉染試劑要求DNA的量多些，有的轉染試劑效率高只要很少DNA，比如Effectene只需要常規五分之一的DNA。所以轉染前hao能定量質粒。另外由于質粒本身的因素（比如目的基因產物是否有毒、啟動子強弱等因素），單獨DNA也會對細胞生長有一個基礎的影響，所以同時做幾組不同量的對照實驗進行優化是很有幫助的。另外值得注意的是，當細胞鋪板密度較高時，需要的質粒DNA和轉染試劑的量也會略微提高。