CRISPR技術 基因敲除技術
原核生物規律成簇的間隔短回文重復（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制。CRISPR/Cas是出現的一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。

CRISPR技術

一、基因敲除技術服務介紹

原核生物規律成簇的間隔短回文重復（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制。CRISPR/Cas是出現的一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。在這一系統中，crRNA（CRISPR derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點剪切雙鏈DNA達到對基因組DNA進行修飾的目的。目前，CRISPR/Cas9技術已經成功應用于大小鼠基因的KO/KI模型制備。：

二、基因敲除技術服務流程

1、gRNA載體構建

2、gRNA和Cas9體外轉錄成mRNA

3、mRNA顯微注射（F0模型生產）

4、F1模型生產

三、CRISPR/Cas9技術特點和優勢

1、可實現對靶基因多個位點同時敲除。

2、實驗周期短，zui快僅需2個月。

3、無物種限制。

TALEN靶向敲除技術

一、基因敲除技術服務介紹

TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nuclease）技術是基于對DNA識別的TALEN臂和人工改造的核酸內切酶的切割域（Fok I）的結合對細胞基因組進行修飾而實現的。TAL的核酸識別單位由34個氨基酸組成，其與DNA序列結合的特異性取決于第12位和第13位氨基酸殘基（重復可變的雙聯氨基酸位點，RVDs）。RVDs和A、T、C、G就恒定的對應關系，即NI識別A、NG識別T、NN識別G、HD識別C。因此，要識別特定的核酸序列，只需將TAL識別模塊按照對應的核苷酸序列串聯組裝即可，通常會在目的基因中選擇兩處相鄰（間隔15-20個堿基）的靶序列（長度為16-20bp的DNA序列）分別進行TALE識別模塊的構建。通過DNA識別域結合到靶位點上，以及FokI的切割域形成二聚體后，可特異性對目標基因DNA實現切斷。在非同源末端連接修復過程中，DNA雙鏈斷開后會由于堿基的隨機增減造成目標基因功能缺失。該技術目前已成功應用于植物、細胞、酵母、斑馬魚及大、小鼠等各類模式動物的研究領域。

二、基因敲除技術服務流程

1、設計、構建TALEN質粒

2、TALEN質粒體外轉錄成mRNA

3、mRNA原核顯微注射（F0小鼠生產）

4、F1小鼠生產

三、技術特點

1、無基因序列、細胞、物種限制，幾乎可敲除任意基因。

2、實驗設計簡單準確、實驗周期短、成本低。

3、毒性低、脫靶情況少；成功率幾乎可達*。

4、TAL的核酸識別單元與A、G、C、T有恒定的對應關系。

5、可識別任意目標基因序列，且不受上下游序列影響。