細(xì)胞介紹
該細(xì)胞來源于人靜脈內(nèi)皮，可在半固體培養(yǎng)基中形成克隆，在免疫抑制小鼠中不能形成腫瘤。
該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶RFP基因。
細(xì)胞特性
1）來源：人臍帶組織
2）形態(tài)：內(nèi)皮細(xì)胞樣貼壁生長
3）含量：>1x10E6細(xì)胞數(shù)
4）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝
5)用途：僅供科研使用。
運(yùn)輸和保存
干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞
（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。
（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。
細(xì)胞接收后的處理：
1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。
2）請(qǐng)?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。
3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的*培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。
4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后第，一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代。
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
準(zhǔn)備內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系
內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基93%
胎牛血清（FBS）5%
內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)添加劑1%
青，霉，素/鏈，霉，素，P/S1%
1）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
2）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
二．細(xì)胞處理：
1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL*培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰，蛋，白，酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的*培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3）細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
下面T25瓶為例；
1.細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.
2.1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3.將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
