蛋白純化系統(tǒng)中親和純化常見(jiàn)問(wèn)題如何解決？

1. 鎳柱使用中出現(xiàn)棕色是怎么回事?
出現(xiàn)這樣的情況，主要是緩沖液中 DTT 的影響， DTT 會(huì)對(duì)鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響，在堿性的緩沖液條件下鎳離子會(huì)被 DTT 還原生成
棕色的沉淀，所以所有鎳柱的生產(chǎn)商都強(qiáng)調(diào)要盡量避免 DTT 的參與（一般的鎳柱耐受小于 5mM DTT,推薦緩沖液中不要超過(guò)2mM DTT）。
2. 通過(guò) His 標(biāo)簽純化的蛋白，雜帶比較多，如何改進(jìn)？
（1）如果蛋白純化的是上清，蛋白酶會(huì)部分降解目的蛋白，可通過(guò)加多種蛋白酶控制劑改進(jìn)。
（2）可提高雜蛋白與鎳柱結(jié)合起始咪唑濃度，以降低雜蛋白與鎳柱的親和力。
（3）雜蛋白和目的蛋白結(jié)合，可通過(guò)超聲前加入去垢劑的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。
3. 鎳柱堵了怎么辦？
（1）柱子發(fā)生堵塞，可能是樣品中細(xì)胞碎片或其他雜顆粒所致，所以樣品一定要高速離心。
（2）上清純化時(shí)，蛋白發(fā)生變性，有絮狀物產(chǎn)生，趕緊加入 1-2mM DTT (上清樣品處理要在冰浴中進(jìn)行)，還不行加尿素變性，使其在變形環(huán)境下。
（3）樣品處理時(shí)的料液比不要太小，否則黏度大，或者導(dǎo)致蛋白析出或變性，料液比要在1/10-1/15 之間較適宜。
4. 純化過(guò)程中，蛋白出現(xiàn)了渾濁，怎么辦？
（1）出現(xiàn)渾濁，說(shuō)明蛋白處在不穩(wěn)定的環(huán)境中或者自身就不穩(wěn)定，所以要檢查緩沖體系是否正確，環(huán)境是否低溫，或在緩沖液中加入還原劑 DTT。
（2）加入肌氨酸鈉，迅速使蛋白變性，消除渾濁現(xiàn)象。
5. 如何處理樣品，可使其初步提純（如何洗去蛋白的自身帶）？
（1）上清樣品處理，要加入去污劑，蛋白酶控制劑，還原劑，還要注意溫度及超聲破碎的參數(shù)。
（2）去大腸桿菌自身帶（兩條 30KD-40KD）可用非變性緩沖液超聲懸浮（加入去垢劑），離心 6000r/min,30min,10℃。（若效果不夠可繼續(xù)上述步驟）。
（3）大腸桿菌包涵體的洗滌，可用包涵體洗液多洗幾遍，也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解，可選取其中純度較佳的。
（4）可用硫酸銨沉淀法，初步提純。
6. 蛋白掛在柱子上洗脫不下來(lái),怎么解決？
（1）洗脫條件太溫和（組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在柱上，結(jié)合力較強(qiáng)） 策略：用增加咪唑的梯度洗脫或降低 pH 來(lái)找出較佳的洗脫條件。
（2）降低 PH 的方法洗脫的,因 為若 PH 低于 3.5,會(huì)導(dǎo)致鎳離子脫落 策略：改變洗脫辦法,咪唑競(jìng)爭(zhēng)性洗脫
（3）蛋白已沉淀在柱上 策略：減少上樣量和孵育的時(shí)間，試用去污劑(1%-2%Tritonx-100)或改變 NaCl 的濃度，或在變性條件下洗脫(用 8M 脲，或 6M 鹽酸胍)，也可在洗脫 Buffer中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸鈉進(jìn)行洗脫。
（4）非特異性疏水或其他相互反應(yīng) 策略：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如，2%Triton X-100）或增加 NaCl 的濃度。
7. 沒(méi)能純化到帶 His 標(biāo)簽的蛋白，蛋白都流穿了（未掛柱）？
（1）超聲的功率不對(duì)(太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒(méi)有釋放) ；
 策略：改變超聲功率，并在超聲前加入溶菌酶。
（2）樣品或者是結(jié)合緩沖液不正確 ；
策略：檢測(cè) pH 及樣品和結(jié)合緩沖液的組成份（EDTA）。
（3）組氨酸的標(biāo)簽沒(méi)有*的暴露 ；
 策略：在變性條件下(用 8M 脲，6M 鹽酸胍,1%SDS) 并加入 1-2mMDTT 進(jìn)行純化。
（4）His 標(biāo)簽丟失；
策略 1：WB 或者 anti-his 的抗體檢查 His 是否表達(dá)，上游構(gòu)建，改變his-tag 的位(C-terminal or N-terminal)，必要時(shí)增加 his 個(gè)數(shù)(常用 6-10 個(gè))；
策略 2：孵育的時(shí)間不夠，降低流速和增加孵育的時(shí)間；
策略 3：改變螯合的金屬離子，尋找到較佳的結(jié)合金屬離子。
Ni2+通常是從宿主細(xì)胞蛋白中純化大多數(shù)(組氨酸)6 標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的金屬離子，也是一般常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結(jié)合強(qiáng)度受幾種因素影響，包括長(zhǎng)度、位置、親和標(biāo)記在蛋白的暴露程度、所用離子的類(lèi)型、以及緩沖液的 pH，因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進(jìn)行純化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 來(lái)篩選不同的金屬離子。