移動端
直播推薦
回放
回放
淀粉蛋白腦室內注射建立阿爾茨海默病大鼠模型
【摘要】 目的 觀察β淀粉樣蛋白（Aβ） 腦室內注射建立阿爾茨海默病（AD） 大鼠模型及其對大鼠行為、*乙酰轉移酶（ChAT）活性、細胞凋亡、神經生長因子（NGF） 水平等影響。方法 將Aβ1242 注射入大鼠側腦室,于第1 周、2 周、4 周觀察Morris 水迷宮逃避潛伏期、測定腦內ChAT 活性、進行原位末端標記凋亡染色及NGF 免疫組化染色。結果 Aβ1242 注射后第2 周大鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期延長,4 周時更明顯。2 周后海馬、皮層ChAT 活性下降,4 周后腦內ChAT 活性廣泛下降,以海馬zui為顯著。2 周后基底前腦Meynert核區凋亡細胞較其他腦區增多,NGF 陽性細胞明顯減少。結論 Aβ腦室內注射可以模擬AD 行為改變,使腦內ChAT 活性降低,基底前腦NGF 含量減少,*能神經元凋亡,可以作為AD 研究模型。
【關鍵詞】 阿爾茨海默病 β淀粉樣蛋白 *乙酰轉移酶 神經生長因子
【中圖分類號】 R749. 1 【文獻標識碼】 A
阿爾茨海默病（Alzheimer Disease , AD） 發病的中心環節是β淀粉樣蛋白（β2amyloid protein ,Aβ） 在腦中的沉積[1 ] ,多種神經元尤其是*能神經元原發性變性,腦內*乙酰轉移酶（cholineacetyl transferase ,ChAT） 活性下降,是AD 的標志性生化改變[2 ] 。AD 等神經系統變性疾病與細胞凋亡的發生密切相關[3 ] ,而神經生長因子（nerve growth factor ,NGF） 是中樞*能系統重要的神經營養因子,具有明顯的抗凋亡作用[4 ] 。
AD 基礎研究和藥物開發的zui大障礙是缺乏一種與AD 病理、生化、和行為等改變相似的理想動物模型。本實驗通過Aβ腦室內注射建立AD 大鼠模型,觀察大鼠行為學改變、腦內各部位ChAT 活性變化、神經元凋亡情況,以及NGF 水平改變,為進一步的AD 治療研究提供動物模型。
1 材料與方法
111 動物分組及Aβ腦室內注射 雄性Wistar 大鼠48 只,體重260～300 g ,隨機分為4 組:對照組、Αβ注射后7 天組、14 天組、28 天組,每組12 只。大鼠麻醉后用微量注射器緩慢將藥物注入右側腦室（前囪后018 mm ,中線旁開111 mm ,深度316 mm） 。Aβ模型組注射Aβ1242 （購自美國AnaSpec 公司） ,每次7 μg ,連續3天,對照組注射生理鹽水,每次7μL ,連續3 天。
112 Morris 水迷宮試驗 參照文獻方法[5 ] ,記錄大鼠找到平臺所需逃避潛伏期。各實驗組分別于zui后1 次藥物注射后第5～7d ,12～14 d ,26～28 d 進行試驗,對照組同時試驗。
113 取材 Aβ注射組分別于zui后1 次藥物注射后第7 天、14天、28 天宰殺取材,對照組于zui后1 次藥物注射后28 天取材。每組取6 只快速斷頭取腦,立即凍于液氮中,待測ChAT 活性。另6 只4 %多聚甲醛透心灌注后于4 %多聚*中固定72小時以上,進行TUNEL 凋亡染色及NGF 免疫組化染色。
114 ChAT活性檢測及定量分析 液氮中凍存腦組織分別取海馬、基底節、額葉、頂葉皮層制備5 %（V/ W） 腦組織勻漿, 按照Fonnum[6 ]的放免方法,在70μL 總反應體積中,含試樣液或空白對照液20μL ,1114 g/ L 乙酰輔酶A（Sigma 公司） 10μL ,70 mmol/L *（Sigma 公司） 8μL ,1 mmol/ L 溴化新斯的明（Sigma 公司） 7μL ,3 mmol/ L 氯化鈉7μL ,317 ×104 Bq/ mL 14C2乙酰輔酶A 10μL ,在液體閃爍儀上測定每分鐘衰變數（cpm） 。以對照組各部位衰變數為100 % ,計算各組各部位ChAT 相對活性。
115 TUNEL 凋亡染色及半定量分析 選取基底節、海馬、額葉、頂葉同時存在矢狀斷面切片,按TUNEL 凋亡染色試劑盒（武漢博士德公司） 說明書操作,進行TUNEL 細胞凋亡染色。每只鼠腦染色2 張切片,每一切片高倍視野（400 ×） 下每部位取4 個視野共計數100 個神經元,計算凋亡神經元陽性百分率,即神經元凋亡指數（NAI） 。
116 NGF 免疫組化染色及圖像分析 取上述石蠟切片,按NGF免疫組化試劑盒（武漢博士德公司） 說明書操作染色。每只鼠腦染色2 張切片,每一染色片高倍視野（400 ×） 下取5 個視野,用美國UIC 公司Metamorph Image System V416 圖像分析軟件得出陽性染色細胞平均灰度值（Average gray value Average） 。
117 統計學分析 計量資料用均數±標準差（ x ±s） 表示,各組間ChAT 活性、水迷宮試驗潛伏期、NGF 陽性神經元平均灰度值比較采用t 檢驗,神經元凋亡指數組間比較采用χ2 檢驗。
2 結果
211 Morris 水迷宮試驗結果 各組逃避潛伏期分別為:對照組（1211 ±514） s ;Aβ注射后7 天組為（1411 ±519） s ,Aβ注射后14天組為（2116 ±617） s ,Aβ注射后28 天組為（4510 ±1013） s。Aβ注射后7 天潛伏期與對照組比較無變化,注射后14 天潛伏期延長（ P < 0105） ,注射后28 天潛伏期明顯延長（ P < 0101） ,提示大鼠學習記憶功能受損。
212 Aβ腦室注射對ChAT 活性影響 Aβ腦室內注射對腦內ChAT 活性影響見表1 。
表1 Aβ對ChAT活性（ cpm） 影響
組 別 額葉基底節海馬頂葉
對 照 組1208. 5 ±49. 8 3662. 3 ±118. 5 2584. 0 ±98. 8 1184. 2 ±53. 2
Aβ注射后7 天1183. 8 ±26. 7 3559. 7 ±120. 3 2513. 0 ±99. 8 1139. 3 ±43. 6
Aβ注射后14 天1033. 4 ±47. 92）3507. 5 ±126. 6 2234. 2 ±84. 52） 1088. 3 ±63. 01）
AB 注射后28 天950. 1 ±67. 52）3228. 5 ±153.
02） 1833. 0 ±57. 62） 941. 8 ±42. 42）
1） 與對照組比較, P < 0. 05 2） 與對照組比較, P < 0. 01
腦室內注射Aβ7 天后,各部位腦組織ChAT 活性無明顯下降,
14 天后海馬、額葉ChAT 活性明顯下降,28 天后各腦區ChAT 活性均明顯下降（ P < 0101） ,以海馬下降zui明顯,降至對照組的71 %。
213 Aβ對腦內神經元凋亡的影響 TUNEL 凋亡染色可見細胞核呈棕黃色染色的陽性凋亡細胞,對照組及注射后7 天各腦區見個別散在凋亡細胞,Aβ注射后14 天可見少量凋亡細胞,28 天后明顯增多,NAI 升高,基底前腦Meynert 核區達1917 % ,海馬、額葉、頂葉分別為617 % ,512 % ,413 % ,Meynert 核區神經元凋亡明顯多于海馬及皮層（ P < 0101） 。Meynet 核凋亡染色見圖1 。
214 Aβ對腦內NGF 表達水平的影響 NGF 免疫組化染色于海馬、額葉、頂葉、基底前腦均可見胞質黃褐色深染陽性細胞,Aβ注射7 天后無明顯變化,14～28 天可見基底前腦區NGF 陽性細胞明顯減少,染色變淺,其他腦區NGF 表達水平無明顯變化。基底前腦區NGF染色見圖2 。用美國UIC 公司Metamorph Image System V416 圖像分析軟件得出陽性染色細胞平均灰度值（Average gray value） 。
表2 NGF 免疫組化染色細胞平均灰度值
組 別 額葉基底節海馬頂葉
對 照 組135. 48 ±17. 27 129. 67 ±18. 49 126. 87 ±9. 56 138. 46 ±13. 54
Aβ注射7 天后129. 32 ±14. 47 134. 57 ±10. 38 125. 48 ±8. 21 139. 76 ±9. 72
Aβ注射后14 天131. 21 ±17. 82 149. 65 ±9. 431） 129. 24 ±12. 59 128. 45 ±12. 43
Aβ注射后28 天126. 34 ±15. 97
175. 54 ± 12.
942） 116. 75 ±11. 16 128. 27 ±10. 03
1） 與對照組比較, P < 0105 2） 與對照組比較, P < 0101
3 討論
近十多年積累的資料表明,前腦基底核的*能神經元、海馬和它們之間的通路,是學習記憶功能的重要結構基礎,損毀這些結構或老齡化,可引起這些區域退化,導致智力嚴重缺損[7 ] 。ChAT 是ACh 的生物合成酶,存在于*能神經元中,是衡量*能神經元功能的標志,也是AD 動物模型成功的標志性生化指標[2 ,8 ] 。迄今為止,多數AD 物模型（如老年動物代替模型、*能系統損毀模型、轉基因小鼠模型） 是在模仿AD 早期出現的記憶障礙或病理特征,使其應用受到局限。本實驗采用大鼠急性腦室內注射Aβ1242 ,4 周內大鼠水迷宮試驗表現逐漸下降,出現了AD 表現,與文獻報道一致[9 ] 。腦內海馬、基底節,以及額葉、頂葉新皮層ChAT 活性均明顯下降,降至對照組水平70 %以下,說明Aβ腦室內注射對腦內ChAT 活性的影響是廣泛和明顯的。Aβ沉積是AD 發病的中心環節和病理特征,本模型全面模擬了AD 病理、行為學和生化改變,因此腦室內Aβ注射可以作為一種理想的AD 模型制作方法。ChAT 活性的下降實際上反映了*能神經元功能的下降或變性,近年來越來越多的證據表明,*能神經元退化的主要方式也是細胞凋亡[3 ] 。本實驗發現ChAT 活性降低的同時,腦內基底節、海馬等處的凋亡神經元增多,并且以*能神經元聚集的基底前腦區更為明顯,所以ChAT 活性的降低可能源于Aβ所致的*能神經元凋亡。基底前腦*能神經元發出纖維投射到海馬、邊緣葉及大腦皮層,這些部位靶細胞中產生的NGF 通過*能神經元的軸突末梢攝取后,經軸漿逆向運至其胞體所在的神經節,是基底前腦、隔區*能神經元的主要營養因子。Aβ腦室內注射后2 周開始,基底前腦神經元NGF 含量減少,4 周時zui明顯,推測在本模型中,由于NGF 對基底前腦中樞*能神經元營養、支持作用減弱,導致神經元發生凋亡,引起AD 的一系列行為學、生化改變。如果能采用基因治療等方法及時補充基底前腦NGF ,將有可能治療AD 癥狀,延緩AD 的進展,目前基因治療AD 是國內外研究的熱點,也是我們下一步的研究方向[10 ] 。綜上所述,Aβ腦室內注射造成大鼠AD 樣行為學改變,腦內ChAT 活性降低,基底前腦NGF 含量減少,*能神經元凋亡,可以作為AD 研究的動物模型。
免責聲明
- 凡本網注明“來源：儀器網”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網絡有限公司-儀器網合法擁有版權或有權使用的作品，未經本網授權不得轉載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經本網授權使用作品的，應在授權范圍內使用，并注明“來源：儀器網”。違反上述聲明者，本網將追究其相關法律責任。
- 本網轉載并注明自其他來源（非儀器網）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責，不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網站或個人從本網轉載時，必須保留本網注明的作品第一來源，并自負版權等法律責任。
- 如涉及作品內容、版權等問題，請在作品發表之日起一周內與本網聯系，否則視為放棄相關權利。
浙公網安備 33010602002722號
2025廣州國際分析測試及實驗室設備展覽會暨技術研討會
展會城市：廣州市展會時間：2025-03-05