凝膠電泳儀通常用于分析用途,但也可以作為制備技術,在采用某些方法(如質譜(MS)、聚合酶鏈式反應(PCR)、克隆技術、DNA測序或者免疫印跡)檢測之前部分提純分子。
一、使用方法
該技術操作簡便快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度離心法)所無法分離的DNA片段。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆技術操作。
二、產品應用
凝膠電泳被廣泛用于分子生物學、遺傳學和生物化學:1.大的DNA或者RNA分子通常利用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)分離,也可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。2.蛋白質的凝膠電泳通常在加入十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠中進行(SDS-PAGE),或者非變性凝膠電泳,或二維電泳。SDS-PAGE蛋白質凝膠電泳圖。3.毛細管電泳。4.酶譜法(zymography)。5.變性梯度膠凝電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)。瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力*,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進行電泳。目前,一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。
瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質,其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:
1、DNA的分子大?。壕€狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。
2、瓊脂糖濃度
一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、DNA分子的構象
DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動zui快,而開環雙鏈DNA移動zui慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收,用同一種限制性內切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。
三、維護與保養
電泳儀通電進入工作狀態后,禁止人體接觸電極、電泳儀電泳物及其它可能帶電部分,也不能到電泳儀電泳槽內取放東西,如需要應先斷電,以免觸電。同時要求電泳儀必須有良好接地端,以防漏電。
電泳儀通電后,不要臨時增加或撥除輸出導線插頭,以防短路現象發生,雖然電泳儀內部附設有保險絲,但短路現象仍有可能導致電泳儀損壞。
由于電泳儀不同介質支持物的電阻值不同,電泳儀電泳時所通過的電流量也不同,其電泳儀泳動速度及泳至終點所需時間也不同,故電泳儀不同介質支持物的電泳不要同時在同一電泳儀上進行。
在總電流不超過電泳儀額定電流時(zui大電流范圍),可以多槽關聯使用,但要注意不能超載,否則容易影響電泳儀壽命。
某些特殊情況下需檢查電泳儀電泳輸入情況時,允許在穩壓狀態下空載開機,但在穩流狀態下必須先接好負載再開機,否則電壓表指針將大幅度跳動,容易造成不必要的人為電泳儀損壞。
使用過程中發現電泳儀異?,F象,如較大噪音、放電或異常氣味,須立即切斷電泳儀電源,進行檢修,以免發生意外事故。
一、使用方法
該技術操作簡便快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度離心法)所無法分離的DNA片段。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆技術操作。
二、產品應用
凝膠電泳被廣泛用于分子生物學、遺傳學和生物化學:1.大的DNA或者RNA分子通常利用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)分離,也可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。2.蛋白質的凝膠電泳通常在加入十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠中進行(SDS-PAGE),或者非變性凝膠電泳,或二維電泳。SDS-PAGE蛋白質凝膠電泳圖。3.毛細管電泳。4.酶譜法(zymography)。5.變性梯度膠凝電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)。瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力*,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進行電泳。目前,一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。
瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質,其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:
1、DNA的分子大?。壕€狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。
2、瓊脂糖濃度
一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、DNA分子的構象
DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動zui快,而開環雙鏈DNA移動zui慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收,用同一種限制性內切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。
三、維護與保養
電泳儀通電進入工作狀態后,禁止人體接觸電極、電泳儀電泳物及其它可能帶電部分,也不能到電泳儀電泳槽內取放東西,如需要應先斷電,以免觸電。同時要求電泳儀必須有良好接地端,以防漏電。
電泳儀通電后,不要臨時增加或撥除輸出導線插頭,以防短路現象發生,雖然電泳儀內部附設有保險絲,但短路現象仍有可能導致電泳儀損壞。
由于電泳儀不同介質支持物的電阻值不同,電泳儀電泳時所通過的電流量也不同,其電泳儀泳動速度及泳至終點所需時間也不同,故電泳儀不同介質支持物的電泳不要同時在同一電泳儀上進行。
在總電流不超過電泳儀額定電流時(zui大電流范圍),可以多槽關聯使用,但要注意不能超載,否則容易影響電泳儀壽命。
某些特殊情況下需檢查電泳儀電泳輸入情況時,允許在穩壓狀態下空載開機,但在穩流狀態下必須先接好負載再開機,否則電壓表指針將大幅度跳動,容易造成不必要的人為電泳儀損壞。
使用過程中發現電泳儀異?,F象,如較大噪音、放電或異常氣味,須立即切斷電泳儀電源,進行檢修,以免發生意外事故。
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