細胞:過表達就是把基因上調表達,即該基因被過度的轉錄、翻譯,終基因表達產物超過正常水平。做過表達要比做干擾難度高一些,過表達需要表達出長鏈的 mRNA,這一點比較困難,而干擾只需表達出短片段的 shRNA 即可。
一般情況下,如果本身就是高表達,你再做過表達就比較困難,某種程度上干擾更為重要,想說明一個基因對于一個事件是必須的,只有把它拿掉,事件終止(或程度減弱),才比較有說服力。但是,如果你的基因在細胞中基礎表達本身就不高的話,還是有必要來選擇過表達實驗來對其表型進行驗證的,否則實驗會受到質疑。
關于下調基因表達,一般來說干擾穩轉株能滿足實驗所需。但是,干擾穩轉株不能控制 shRNA 插入染色體的位置,染色體上的 shRNA 有時會丟失,另外 shRNA 也有脫靶效應,可能干擾了其他未知基因。還有就是,shRNA 是與目的基因的 mRNA 作用而使之降解,是在 RNA 水平上的降低目的基因的表達。
此時,基因敲除穩轉株可以很大程度上規避這個問題。因為基因敲除穩轉株是在基因組水平上通過基因序列的改變使其基因功能喪失,在敲除細胞中通常不會檢測到靶蛋白的表達,而且敲除效果穩定,不能恢復,也就是yong久性敲除了。但是基因敲除穩轉株缺點是操作周期長,費用多,效率低。如何選擇基因下調表達的方式,就要綜合考慮了。
那么同樣是穩定株,單克隆?混合克隆?要怎么選?
細胞:當需要去除細胞群體干擾因素的時候,*使用單克隆穩定細胞株,其基因組背景相對單一,對實驗結果干擾因素小。當進行系統生物學研究時,需考慮細胞群體因素,同時也是由于不同細胞個體差異大,而且不同整合位點的單克隆細胞株表現出來的細胞行為可能不一致,所以許多實驗使用混合克隆株更能去除細胞間差異造成的干擾。因此,選擇單克隆細胞株還是混合克隆細胞株,需要根據實驗目的而定。
好極了,怎么判別篩選的穩定株是單克隆呢?
細胞:如果外源片段含有熒光標記,可以直接使用流式細胞儀檢測其熒光是否均一;如果還有其它標簽,可以進行免疫熒光標記,再使用流式細胞儀觀察熒光分布是否出現均一峰值;
如果外源片段不含任何標簽或者熒光標記,則可以使用分子生物學比如 Southern Blot 的方法鑒定; 還可使用 96 孔板稀釋法篩選,得到的陽性克隆一般是單克隆。
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