產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 保存 |
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液 | C4058L1080 | 1mL | 4℃ |
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液 | C4058L1082 | 50mL | 4℃ |
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液 | C4058L1084 | 500mL | 4℃ |
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液（23966）產(chǎn)品說(shuō)明
EZ Trans 是一種具有較高的陽(yáng)離子電荷密度的有機(jī)大分子，每相隔二個(gè)碳原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何 pH 下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”體。其轉(zhuǎn)染性能好于樹(shù)枝狀聚合物，而且它的細(xì)胞毒性低。
使用方法
1. 接種細(xì)胞：用膠原酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)（不建議用*）。轉(zhuǎn)染前 18-24 小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞的鋪板，以便在轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞的密度
大約在 80%左右。注：培養(yǎng)液中的血清和抗生素不影響轉(zhuǎn)染效率。
2. 準(zhǔn)備 EZ Trans-DNA 復(fù)合物
1）轉(zhuǎn)染前將所有試劑置于室溫 10 分鐘。下面，以轉(zhuǎn)染 24 孔板培養(yǎng)皿為例，說(shuō)明轉(zhuǎn)染的具體方法（如果在別的培養(yǎng)器皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，各試劑建議使用量見(jiàn)表 1.：
2）將 1 μg 質(zhì)粒 DNA 稀釋到 40 μL 無(wú)血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基，用移液槍吹吸 3-4 次。
3）將 3 μL EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑稀釋到 40 μL 無(wú)血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基，用移液槍吹吸 3-4 次。
注： 無(wú)血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基是稀釋液， 不能使用含血清的培養(yǎng)基（ 包括 Opti-MEM） 進(jìn)行 DNA 和 EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑的稀釋！因?yàn)?EZ Trans-DNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成過(guò)程不能含有血清。
4）將稀釋好的 EZ Trans 轉(zhuǎn)染試劑一次性全部加入到已稀釋好的質(zhì)粒 DNA 中，立即用移液槍吹吸 3-4 次。
注： 此混合的順序不能反向進(jìn)行！
5）室溫放置 10-15 分鐘，以形成 EZ Trans-DNA 復(fù)合物。
表1：不同培養(yǎng)體積對(duì)應(yīng)的待轉(zhuǎn)DNA、EZ Trans、稀釋液用量
培養(yǎng)器皿 | 培養(yǎng)液體積（mL） | DNA量（μg） | EZ Trans (μL) | 稀釋劑(μL) |
48孔板 | 0.3 | 0.5 | 1.5 | 2 × 25 |
24孔板 | 0.5 | 1 | 3 | 2 × 40 |
12孔板 | 0.75 | 1.5 | 4.5 | 2 × 60 |
6孔板 | 1 | 3 | 9 | 2 × 125 |
35 mm培養(yǎng)皿 | 1 | 3 | 9 | 2 × 125 |
60 mm 培養(yǎng)皿 | 3 | 6 | 18 | 2 × 250 |
100 mm 培養(yǎng)皿 | 9 | 12 | 36 | 2 × 500 |
3. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞
1）將上述 80 μL EZ Trans-DNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴入到含細(xì)胞的培養(yǎng)皿中。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿或輕微渦旋，讓 EZ Trans-DNA
復(fù)合物分散均勻。
2）在 CO2 培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后 12-18 小時(shí)，去除含 EZ Trans-DNA 復(fù)合物的培養(yǎng)液。（若細(xì)胞形態(tài)欠佳，可
在轉(zhuǎn)染 3-5h 后，添加 1/2 體積的包含 30%血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染 12-18 小時(shí)后*去除含 EZ Trans-DNA 復(fù)合物的培養(yǎng)液，
用含血清和抗生素的新鮮培養(yǎng)液。）
3）轉(zhuǎn)染后zui快 7h 即可檢測(cè)到轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)，可根據(jù)需要在 24-48 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
注： 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株， 可在上述操作后（ 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 24 小時(shí)后） ， 將細(xì)胞傳代至新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中（ 將細(xì)胞稀釋 10 倍以
上） ， 在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃孵育過(guò)夜。 在有轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的藥物篩選條件下， 約 1～2 周可篩選到耐藥性克隆， 在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液（23966）運(yùn)輸與保存方法
常溫運(yùn)輸，4℃保存，保質(zhì)期12個(gè)月。
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液（23966）使用注意事項(xiàng)
質(zhì)粒質(zhì)量：請(qǐng)務(wù)必使用高質(zhì)量轉(zhuǎn)染級(jí)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒。通過(guò) 260 nm 光吸收測(cè)定 DNA 濃度，260nm / 280nm 比值確定 DNA
純度（比值應(yīng)該在 1.8～2.0 的范圍之內(nèi)）。如有可能，請(qǐng)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的完整性。
細(xì)胞條件：使用適當(dāng)保存和經(jīng)常傳代的健康細(xì)胞。確保培養(yǎng)基沒(méi)有被細(xì)菌、真菌或支原體污染。如果細(xì)胞是近期復(fù)蘇的液氮
凍存細(xì)胞，請(qǐng)?jiān)谵D(zhuǎn)染前至少傳代兩次。建議使用 GIBCO 或者李記生物的胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞。
特別提醒
1. 對(duì)于某些類型的細(xì)胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前兩天鋪板可顯著提高轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)水平。
如果選擇轉(zhuǎn)染前兩天鋪板，可適當(dāng)降低鋪板密度，以確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度仍為 70～80%。
2. 對(duì)于接觸抑制敏感的細(xì)胞，可適當(dāng)降低鋪板密度。
3. 即使在有蛋白（如 10%的血清）存在的情況下，DNA-PEI 復(fù)合物仍能轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但是 DNA-PEI 復(fù)合物必須在無(wú)蛋白存在的條
件下形成。
4. 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)而言，每 1μg DNA 使用 3.0 μL EZ Trans 試劑都能獲得較高轉(zhuǎn)染效率。使用者也可嘗試每 1 μg DNA 使用
1～4μL 體積線性 PEI 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行優(yōu)化。
EZ Trans轉(zhuǎn)染液用于不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)用量參考（以96孔板為例）
細(xì)胞型號(hào) | 培養(yǎng)基 | 每孔細(xì)胞數(shù) | DNA的量 | 轉(zhuǎn)染試劑量 |
293H | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
293FT | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
293E | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
293F | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
COS7 | DMEM | 1.5×104 | 0.4µg | 0.5µL |
hela | DMEM | 2×104 | 0.3µg | 0.5µL |
Caco2 | MEM | 3.5×104 | 0.3µg | 0.75µL |
BHK21 | MEM | 2×104 | 0.2µg | 0.5µL |
CHO-DG44 | DMEM+HT+pro | 2×104 | 0.5µg | 0.5µL |
RAW264.7 | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
MCF7 | MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat | 2×104 | 0.1µg | 0.25µL |
SW480 | IMDM | 3×104 | 0.4µg | 0.5µL |
MDCK | DMEM | 4×104 | 0.6µg | 1µL |
CHO-K1 | IMDM+Pro | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
HepG2 | DMEM | 3×104 | 0.5µg | 0.75µL |
A549 | DMEM | 2×104 | 0.3µg | 0.5µL |
NIH/3T3 | DMEM | 1.5×104 | 0.1µg | 0.75µL |
vero | DMEM | 3×104 | 0.3µg | 0.75µL |
sf9 | SIM SF | 5×104 | 0.4µg | 0.75µL |
附：幾種細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法比較
幾種細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法（試劑）特點(diǎn)比較表
轉(zhuǎn)染方法 | 原理 | 主要應(yīng)用 | 特點(diǎn) |
陽(yáng)離子聚合物 （EZ Trans） | 帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 | 除了具有陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡(jiǎn)單，適用范圍廣，重復(fù)性好等特點(diǎn)外，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)，是新一代的轉(zhuǎn)染試劑。 |
陽(yáng)離子脂質(zhì)體法 | 帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電 核結(jié)合；另一種解釋是通過(guò)細(xì)胞是內(nèi)吞作用而被進(jìn)入細(xì)胞。(若DNA濃度過(guò)高，中和脂質(zhì)體表面電核，而降低了與細(xì)胞的結(jié)合能力) | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 | 使用方法簡(jiǎn)單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn) 染各種類型的細(xì)胞，沒(méi)有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染 中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，這在很大程度上限制了其應(yīng)用 |
DEAE-葡聚糖法 | 帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 | 相對(duì)簡(jiǎn)便、重復(fù)比磷酸鈣好,但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副 作用,轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清且一 般只用于BSC-1,CV-1,COS 細(xì)胞系 |
磷酸鈣法 | 磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 染瞬轉(zhuǎn)染 | 不適用于原代細(xì)胞（所需的DNA濃度較高）,操作簡(jiǎn) 便但重復(fù)性差,有些細(xì)胞不適用細(xì)胞建議用CSCL梯度離心，轉(zhuǎn)染是拷貝數(shù)較多 |
逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA) | 通過(guò)病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用而 進(jìn)入宿主細(xì)胞，之后反轉(zhuǎn)入酶 啟動(dòng)合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 特定宿主細(xì)胞 | 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等,但攜 帶基因不能太大（<8kb）, 細(xì)胞需處分裂期,需考慮安 全因素 |
腺病毒 (雙鏈 DNA) | 先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合，繼而在αv整合素介導(dǎo)下被細(xì)胞內(nèi)吞 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 特定宿主細(xì)胞 | 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,需考慮安全因素 |
Biolistic顆粒傳遞法 （基因槍粒子轟擊法） | 將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道 裝置投射入細(xì) 胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達(dá) | 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 | 可用于：人的表皮細(xì)胞， 纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞 |
顯微注射法 | 用顯微操作將 DNA直接注入靶 細(xì)胞核 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 | 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的 胚胎細(xì)胞 |
電穿孔法 | 高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過(guò)膜上形 成的小孔導(dǎo)入 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 | 適用性廣，除了質(zhì)粒外，還可轉(zhuǎn)染大的基因組 （>65kb）但細(xì)胞致死率高， DNA和細(xì)胞用量大， 需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件，拷貝數(shù)較少 1-20 |
Q：C4058L1080和C4058L1090有什么區(qū)別？
A：我們有兩種，80是針對(duì)線性的，90是支鏈轉(zhuǎn)染，比如慢性病包試劑用90比較好。
Q：李記細(xì)胞轉(zhuǎn)染液和PEI固體自行配制溶液相比的優(yōu)勢(shì)在哪里？
A：很多客戶買固體很難把握的，固體非常不容易溶解，包裝比較大，用的不多建議您選液體的，已做無(wú)菌處理，可以直接使用。
Q：接種細(xì)胞，必須用膠原酶消化？*不能用么？
A：膠原酶從細(xì)菌中提取出來(lái)的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用，對(duì)細(xì)胞本身影響不大，可使細(xì)胞與膠原成分脫離但不受傷害。膠原酶消化的不是細(xì)胞表面，而是細(xì)胞間質(zhì)。
*消化作用于與賴氨酸或*相連接的肽腱，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。對(duì)細(xì)胞有輕微影響，進(jìn)而影響后續(xù)轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞活性，在一定程度上體現(xiàn)為轉(zhuǎn)染試劑的毒性。
Q：使用方法提到，轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)將復(fù)合物（40ul質(zhì)粒稀釋液+40ul 轉(zhuǎn)染試劑稀釋液）滴入到含細(xì)胞的培養(yǎng)皿中。此時(shí)含細(xì)胞的培養(yǎng)皿里面有含血清的培養(yǎng)基么？如果有，體積是多少？以24孔板為例，是0.5ml么？
A：培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基成分為正常培養(yǎng)細(xì)胞的成分，原來(lái)培養(yǎng)時(shí)有血清，那就有。培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液的體積也是正常情況，你說(shuō)的對(duì)，如果是24孔板，那么體積應(yīng)該是0.5ml
Q:轉(zhuǎn)染細(xì)胞步驟中提到，去除含復(fù)合物的培養(yǎng)液之后呢？要加含血清的培養(yǎng)基么？加多少，以24孔板為例？加完培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)？培養(yǎng)多久？
A:去除含復(fù)合物的培養(yǎng)基，過(guò)程是逐步的，有兩個(gè)目的，一是盡可能提高轉(zhuǎn)染效率，二是盡可能降低細(xì)胞毒性。減少EZ Trans-DNA復(fù)合物的過(guò)程，也是恢復(fù)到細(xì)胞正常培養(yǎng)基成分的過(guò)程。后續(xù)培養(yǎng)多久，說(shuō)明書為建議時(shí)間，你可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索，要根據(jù)你的轉(zhuǎn)染效率，基因表達(dá)情況確定。
Q:轉(zhuǎn)染細(xì)胞步驟中提到，這里的7h，指的是去除含復(fù)合物的培養(yǎng)液換成含血清的培養(yǎng)基之后的7h，還是指加入復(fù)合物后轉(zhuǎn)染7h?- 同樣的，“24-48小時(shí)內(nèi)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率”指的是去除含復(fù)合物的培養(yǎng)液換成含血清的培養(yǎng)基之后的24-48h，還是指加入復(fù)合物后轉(zhuǎn)染24-48h？
A:所有時(shí)間都是從EZ Trans-DNA復(fù)合物與細(xì)胞接觸開(kāi)始算.
